|
Сторінка 6 Аналіз каталітичної активності АТ після розділення гель-фільтрацією за умов дисоціації імунних комплексів (рН-шок). Препарати АТ піддавали гель-фільтрації на колонці розміром 180 x 5 мм, яка містила Toyopearl TSK HW-55 („Toyo Soda”, Японія). Білки препаратів АТ попередньо осаджували 50% сульфатом амонію й осад розчиняли в 0,1 М гліцин-HCl, рН 2,6 або 50 мМ NaOH. Елюцію білків проводили цими ж розчинами. Хроматографічні фракції (300 мкл) збирали, нейтралізували і діалізували проти буферу, що містив 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,1 М NaCl протягом 18 год. Вміст білків аналізували електрофорезом у градієнті ПААГ (7 - 18,5%) у присутності 0,1% Ds-Na. Для аналізу каталітичної активності від хроматографічних фракцій відбирали аліквоти (30 мкл), додавали 6 мкг субстрату (плазмідна ДНК, гістон Н1) й інкубували 2 год при 37 °С. Продукти реакції розділяли електрофорезом залежно від природи субстрату.
Афінна модифікація білків реакційно здатними аналогами АТР і олігонуклеотидів. Для виявлення АТР - і ДНК-зв'язувальних ділянок на молекулах білків використовували реакційно здатні похідні АТР(ClR-Р-ppA) і [-32P] ATP(ClR-32Р-ppA), а також 32Р-мічений 14-мірний дезоксириботимідилат (ClRCH2NHp(T) 14), які були синтезовані к. б. н. Якубовим Л.А. (Інститут хімічної біології і фундаментальної медицини, Новосибірськ, Російська Федерація). Реакційною групою слугувала алкілуюча сполука 4- [(N-2-хлоретил-N-метил) аміно] бензиламін, приєднана до 5'-кінцевої фосфатної групи олігонуклеотиду або -фосфату [-32P] ATP (рис.2).
Афінну модифікацію білків (sIgA, rsCD4) проводили у забуференому фізіологічному розчині (ЗФР: 0,14 М NaCl, 10 мМ NaН2РО4, рН 7,5) у присутності 10 мкМ алкілуючого реагенту протягом 45 хв при 37 °С. Конкурентами у реакції слугували: ДНК тимусу теляти, сумарна РНК E. coli і гепарин у концентрації 1 мг/мл або 30 мкМ d(T) 14. Після завершення інкубації до реакційного середовища додавали денатуруючий буфер (2% Ds-Na, 50 мМ трис-НCl, рН 6,8, 4% 2-меркаптоетанол, 20% гліцерин) і білки розділяли електрофорезом у 10% ПААГ у присутності 0,1% Ds-Na. Гелі висушували і проводили їхню авторадіографію.
Імуноензимний аналіз (ІЕА). ІЕА проводили згідно описаної нижче методики. Для сорбції антигенів у лунки 96-лункового планшету для імунологічних аналізів вносили 30 мкл розчину, який містив 2 мкг гістонів або дволанцюгову ДНК у 0,1 М K2CO3/KHCO3, pH 8,6, й інкубували протягом 18 год при 4 °С. Лунки промивали (3 рази) 200 мкл буферу А (1% БСА у ЗФР), додавали 15 мкг антитіл у 200 мкл буферу А й інкубували протягом 2 год при 37 °С. Лунки тричі промивали 200 мкл буферу А, додавали 50 мкл розчину кон'югату білок А - пероксидаза хрону ("Sigma", США) у розведенні 1: 500 й інкубували протягом 1 год при 37 °С. Лунки планшету тричі промивали 200 мкл ЗФР у присутності 0,05% Twin-20 і фарбували розчином діамінобензидин/Н2О2 протягом 30 хв при 37 °С. Реакцію зупиняли 1 М ортофосфорною кислотою. Оптичну густину розчину визначали при довжині хвилі 492 нм на спектрофотометрі NanoDrop ND 1000 („NanoDrop Technologies”, США). Рівень ауто-АТ у лунках вираховували за величиною оптичного поглинання розчину забарвлених продуктів пероксидазної реакції. Визначення проводили у трьох паралельних дослідах.
Клітини та їхнє культивування. У роботі використовували клітинні лінії, одержані з колекції Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології НАН України: Jurkat - лейкемічні Т-лімфоцити периферичної крові людини, Namalwa - В-лімфоцити людини (лімфома Беркіта); L1210 - лейкемічні В-лімфоцити миші, L929 - трансформовані фібробласти миші. Клітини культивували у середовищі RPMI-1640 або DMEM („Sigma”, США) у присутності 10% сироватки крові ембріонів ВРХ („Sigma”, США) і 50 мкг/мл гентаміцину.
Аналіз цитотоксичної активності препаратів антитіл. Клітини інкубували із препаратами АТ (кінцева концентрація 0,7 мг/мл) протягом 24, 48 або 72 год. Фарбування клітин проводили 0,1% водним розчином трипанового синього. Кількість незабарвлених живих і забарвлених мертвих клітин підраховували у гемоцитометричній камері під світловим мікроскопом Биолам Р (ЛОМО, Російська Федерація). Індекс життєздатності (IЖ) визначали за формулою: IЖ = O/C x 100, де О - кількість живих клітин у культурі під впливом АТ, С - кількість живих клітин у культурі у відсутності АТ.
|
Сайт
