Антитіла молока і сироватки крові людини характеристика каталітичної активності та вплив на ріст і виживання клітин

Сторінка 5

На рис.1 наведено узагальнену схему очистки ауто-АТ із сироватки крові та молока людини, яка дозволяє отримати препарати антитіл із заданою антигенною специфічністю, збагачені каталітично активними антитілами.

На першій стадії очистки імуноглобуліни осаджували 50% сульфатом амонію. Це дозволяє відділити фракцію імуноглобулінів від основної маси білків сироватки крові чи молока. Наступна стадія включає афінну хроматографію на колонці, яка містить протеїн A - або протеїн G - агарозу (або сефарозу). Для видалення домішок колонки промивали розчинами із підвищеною концентрацією NaCl (0,3-0,5 М) у присутності неіонних детергентів (NP-40, тритон Х-100). Елюцію імуноглобулінів із колонки проводили буфером із низьким значенням рН (1 M оцтова кислота або 0,1 М гліцин-HCl, рН 2,6). Використання цих сорбентів дозволяє уже на перших стадіях очистки отримати препарати, які на 90-95% складаються із імуноглобулінів. Для подальшої очистки антитіл або їхнього розділення на субкласи (наприклад, sIgA та IgG молозива) використовували іонообмінну хроматографію або напівпрепаративну гель-фільтрацію (Невинский та ін., 2000). Препарати антитіл, очищені таким методом, є електрофоретично гомогенними (рис.1А, Б) і придатні для виділення антитіл зі спорідненістю до певних антигенів чи субстратів каталітичної реакції.

Отримані препарати імуноглобулінів у подальшому слугували для виділення моноспецифічних поліклональних антитіл із сироватки крові і молока людини афінною хроматографією на колонках, які містять сорбенти із ковалентно зв'язаними лігандами. Сорбентами слугували: АТР-сефароза, ДНК-целюлоза, гістон Н1-сефароза. Залежно від спорідненості до сорбентів, антитіла елюювали градієнтом концентрації 0-1 М NaCl (анти-АТР IgG сироватки крові хворих на системний червоний вовчак), 3,5 M MgCl2 (анти-АТР sIgA молозива породіль), 50 мМ NaOH (анти-ДНК sIgA молозива породіль), 0,1 М гліцин-HCl, рН 2,6 (антигістонові АТ субкласів IgG та sIgA сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молозива породіль).

Визначення протеїнкіназної активності. Для аналізу протеїнкіназної активності АТ і rsCD4 донором фосфату був [-32P] ATP (5000 Ki/ммоль, “Изотоп”, Російська Федерація). Реакційне середовище містило 0,3 - 3 мкг білка,20 мМ трис-HCl, рН 7,4, 5-10 мМ MgCl2, 25 мкКі [-32P] ATP. У деяких випадках, у реакційне середовище додатково додавали АТР, казеїн коров'ячого або людського молока. Реакцію фосфорилювання проводили впродовж 30 хв при 37 °С і зупиняли додаванням денатуруючого розчину (65 мМ трис-HCl, рН 6,8, 1% Ds-Na, 2% 2-меркаптоетанол, 10% гліцерин) або 10% ТХО. Білки розділяли електрофорезом у 12% ПААГ, або у градієнті 6-16,5% ПААГ у присутності 0,1% DS-Na. Гелі фарбували Coomassie R-250, висушували і піддавали авторадіографії протягом 20 год.

Визначення ліпідкіназної активності. Для аналізу використовували препарати IgG і sIgA різного ступеня очистки. Реакцію фосфорилювання проводили у середовищі, яке містило 20 мM трис-HCl, pH 7,5, 3 мМ MgCl2 і 20 мкКі [g-32P] ATP.32Р-мічені ліпіди екстрагували розчином хлороформ: метанол (2: 1) і розділяли на пластині Kieselgel 60 у системі хлороформ: метанол: 7М NH40H (60: 35: 5). Пластину висушивали і піддавали авторадіографії.

Визначення нуклеазної активності. Нуклеазну активність імуноглобулінів визначали згідно раніше описаної методики (Shuster et al., 1992). Як субстрат використовували надспіралізовану та лінійну форми плазмідної ДНК, тотальну РНК E. coli або рибосомну РНК клітин аденокарциноми людини лінії A549. Для аналізу зразки, які містили 1-5 мкг білка, інкубували із 3-5 мкг нуклеїнових кислот у 20 мМ трис-HCl, 75 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 протягом 1 год при 37 °С. Ефекторами реакції слугували 0,1-3 мМ АТР або 1 мМ GTP, СТР, TTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Продукти реакції розділяли електрофорезом у 1% агарозі у трис-борат-ЕДТА буфері, рН 8,3 у присутності 0,001% бромистого етидію. Гель фотографували при ультрафіолетовому освітленні.

Визначення протеазної активності. Для аналізу протеазної активності АТ субстратами слугували гістони тимусу теляти і цитохром С („Fermentas”, Литовська Республіка). Реакцію гідролізу проводили у буфері, який містив 20 мМ трис-HCl, pH 7,5 у присутності 3 мг/мл білка і 0,05 - 0,3 мг/мл АТ упродовж 1-3 год при 37 °С. Реакцію зупиняли додаванням у реакційне середовище 4-кратного денатуруючого буферу (0,2 М трис-HCl, рН 6,8, 4% Ds-Na, 8% 2-меркаптоетанол, 40% гліцерин) і білки розділяли електрофорезом у 12% ПААГ у присутності 0,1% Ds-Na. Гелі фарбували Coomassie G-250.